Peneliti Belanda menggabungkan CRISPR dan bioluminesensi dalam uji eksperimentalpenyakit menular

Protein nokturnal yang baru dikembangkan dapat mempercepat dan menyederhanakan diagnosis penyakit virus, menurut para peneliti di Belanda.
Penelitian mereka, yang diterbitkan Rabu di ACS Publications, menjelaskan metode satu langkah yang sensitif untuk menganalisis asam nukleat virus dengan cepat dan penampakannya menggunakan protein biru atau hijau terang yang bersinar.
Identifikasi patogen dengan mendeteksi sidik jari asam nukleatnya merupakan strategi utama dalam diagnostik klinis, penelitian biomedis, serta pemantauan keamanan pangan dan lingkungan.Tes reaksi berantai polimerase kuantitatif (PCR) yang banyak digunakan sangat sensitif, namun memerlukan persiapan sampel atau interpretasi hasil yang canggih, sehingga tidak praktis untuk beberapa rangkaian layanan kesehatan atau rangkaian terbatas sumber daya.
Kelompok asal Belanda ini merupakan hasil kolaborasi ilmuwan dari universitas dan rumah sakit untuk mengembangkan metode diagnostik asam nukleat yang cepat, portabel, dan mudah digunakan serta dapat diterapkan di berbagai situasi.
Mereka terinspirasi oleh kilatan kunang-kunang, pancaran kunang-kunang, dan bintang-bintang kecil fitoplankton air, semuanya didukung oleh fenomena yang disebut bioluminesensi.Efek glow-in-the-dark ini disebabkan oleh reaksi kimia yang melibatkan protein luciferase.Para ilmuwan memasukkan protein luciferase ke dalam sensor yang memancarkan cahaya untuk memudahkan observasi ketika mereka menemukan target.Meskipun hal ini menjadikan sensor ini ideal untuk deteksi di tempat perawatan, namun saat ini sensor tersebut kurang memiliki sensitivitas tinggi yang diperlukan untuk uji diagnostik klinis.Meskipun metode pengeditan gen CRISPR dapat memberikan kemampuan ini, metode ini memerlukan banyak langkah dan peralatan khusus tambahan untuk mendeteksi sinyal lemah yang mungkin terdapat dalam sampel yang kompleks dan berisik.
Para peneliti telah menemukan cara untuk menggabungkan protein terkait CRISPR dengan sinyal bioluminescent yang dapat dideteksi dengan kamera digital sederhana.Untuk memastikan ada cukup sampel RNA atau DNA untuk dianalisis, para peneliti melakukan amplifikasi rekombinase polimerase (RPA), sebuah teknik sederhana yang beroperasi pada suhu konstan sekitar 100°F.Mereka mengembangkan platform baru yang disebut Luminescent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), di mana dua protein CRISPR/Cas9 spesifik untuk bagian genom virus yang berbeda dan berdekatan, masing-masing dengan fragmen luciferase unik yang melekat padanya di atasnya.
Ketika genom virus spesifik yang sedang diperiksa oleh para peneliti ada, dua protein CRISPR/Cas9 berikatan dengan rangkaian asam nukleat target;mereka menjadi berdekatan, memungkinkan protein luciferase utuh terbentuk dan memancarkan cahaya biru di hadapan substrat kimia..Untuk memperhitungkan substrat yang dikonsumsi dalam proses ini, para peneliti menggunakan reaksi kontrol yang memancarkan cahaya hijau.Tabung yang berubah warna dari hijau menjadi biru menunjukkan hasil positif.
Para peneliti menguji platform mereka dengan mengembangkan uji RPA-LUNAS, yang mendeteksiRNA SARS-CoV-2tanpa isolasi RNA yang membosankan, dan menunjukkan kinerja diagnostiknya pada sampel usap nasofaringCOVID 19pasien.RPA-LUNAS berhasil mendeteksi SARS-CoV-2 dalam waktu 20 menit pada sampel dengan viral load RNA serendah 200 kopi/μL.
Para peneliti yakin pengujian mereka dapat dengan mudah dan efektif mendeteksi banyak virus lainnya.“RPA-LUNAS menarik untuk pengujian penyakit menular di tempat perawatan,” tulis mereka.